RNAi - מנגנון השתקת גנים - פריצת דרך עתידית?

מאת טליה שלפוק*

תופעת השתקת גנים בעזרת שימוש בטכנולוגיית RNA interference (RNAi) התגלתה זה מכבר כשיטה בעלת חשיבות רבה בחקר ובהבנה של תהליכים ביולוגיים שונים וכן ככלי בעל פוטנציאל רפואי רב עוצמה. מספר הפרסומים בנושא טכנולוגיית ה- RNAi, העומד על    כ-100 פרסומים בחודש, מעיד על העניין הרב שבשימוש בטכנולוגיה זו.

תופעת ה- RNAi ידועה כתופעה טבעית, המתרחשת במרבית היצורים האאוקריוטים ומעורבת במנגנון ההגנה התאית כנגד חדירת גורמים ויראליים לתא וכן כחלק ממערכת הבקרה התאית על תהליך ביטוי החלבונים.

בתהליך השתקת גנים באמצעות גורם RNA מעכב מופחת ביטוי גן מסוים באמצעות  RNA דו גדילי. RNA דו גדילי זה חייב להיות הומולוגי לרצף ה-(mRNA)messenger RNA ששועתק מרצף ה-DNA של הגן בתהליך תרגום הגן לחלבון. כאשר RNA דו גדילי מזוהה בתא, נוצר קומפלקס המבצע את תהליך השתקת ה mRNA. קומפלקס זה נקרא (RISC) RNA Silencing Complex. קומפלקס ה-RISC אחראי לפירוק הספציפי של מולקולות mRNA הומולוגי ל- RNA המעכב, וכתוצאה מכך נפגע תרגום ה- mRNA לחלבון המתאים.

בכוחם של small interfering RNAs (siRNA), המהווים תוצרי הביניים במסלול ה RNAi  והיכולים להיווצר במספר דרכים (ראו איור 1), להשפיע על תפקודו של גן המטרה עד כדי השתקתו (gene knockdown). אופן ההשתקה ויכולת ההכוונה הספציפית בשימוש במסלול הביולוגי הטבעי מבדיל שיטה זו מטכנולוגיות השתקה ידועות אחרות, המבוססות על חומצות גרעין, כגון antisense oligonucleotides.

חמישה מנגנונים המתארים השתקת גנים באורגניזמים אאוקריוטים.

A. antisense oligonucleotides – רצף דנ"א חד גדילי או רצף רנ"א בעל אזור התאמה לרצף ה- mRNA, יכול להיקשר לגדיל      ה- mRNA ולמנוע את תרגום החלבון.

B. מניעת פעילות החלבון על ידי גורם מעכב הנקשר ישירות לחלבון.

C. אוליגונוקלאוטיד פעיל קטליטית יכול לגרום לדגרדציה של גדיל ה- mRNA.

D. מנגנון  ה- siRNA.

E. miRNA אנדוגני.

רקע היסטורי

שינוי פנוטיפי באורגניזם כתוצאה מהפעלת מנגנון ה- RNAi דווח לראשונה לפני כ-15 שנה במספר מחקרים גנטיים, שנערכו בצמחים ובפטריות. שתי קבוצות מחקר שונות עסקו ביצירת צמחים טרנסגניים המכילים גנים לפיגמנטים משופרים, במטרה להפוך את צבעם של צמחי הפיטוניה לכהים יותר. להפתעת החוקרים, לאחר החדרת RNA דו גדילי התוצאות הצביעו על תופעה הפוכה מהצפוי. התקבלו צמחים בעלי צבע מגוון ואף צמחים לבנים לחלוטין.

בשנות ה-90 המאוחרות  הושגה התקדמות ממשית בהבנת מנגנון    ה- RNAi. בלט במיוחד מחקרם של Fire A. וחבריו. RNA דו גדילי שהוזרק לנמטודות (C. elegans) גרם להשתקה של גן המטרה על ידי ירידה כמותית ברמת ה- mRNA. עוד ציינו החוקרים, כי דרוש מספר מועט בלבד של מולקולות על מנת לדכא את ה mRNA של גן המטרה.  Tuschוחבריו הראו, בפעם הראשונה בתאי יונקים, שטרנספקציה של רצפי RNA דו גדילי קצרים (פחות מ 30 זוגות בסיסים) גורמים להפעלת מסלול ה RNAi באופן ספציפי לרצף, גם בתאי יונקים, זאת ללא הפעלת מסלולים אחרים בלתי רצויים (ראה הסבר על תופעות לוואי בהמשך). מחקר זה פתח את הדרך לשימוש במנגנון RNAi ככלי יישומי במחקרים גנטיים ביונקים.  המודל הסופי של מסלול ה RNAi כפי שמוצג באיור 2 התגבש בהמשך.

מנגנון הפעולה

מנגנון השתקת גנים על ידי שימוש בטכנולוגיית RNAi מבוסס על מקטעי חומצות ריבונוקלאיות דו גדיליות double-stranded RNA dsRNAs)) אשר בנוכחותם גורמים לשרשרת אירועים המדכאת בסופה  את ביטויו של גן המטרה. dsRNAs נחתכים בתא על ידי אנזים המכונה DICER, לרצפים קטנים בעלי 519-2 זוגות בסיסים small interfering RNAs (siRNA). החדרת רצפי siRNA באופן מלאכותי לתא נעשית, למשל, על ידי טרנספקציה בעזרת ליפוזומים או מגוון תכשירים ליפידיים ואחרים. ניתן לבצע החדרה ישירה של רצפי  siRNAאו להחדיר וקטור הנושא את רצף הנוקלאוטידים הדרוש.

רצפי siRNA אלו משתלבים בקומפלקס הרב חלבוני RISC (ראו איור 1). קומפלקס זה גורם להפרדת צמד גדילי ה siRNA. גדיל ה- antisense (הגדיל בעל המבנה המשלים ל- mRNA) של רצף ה- siRNA נותר בקומפלקס ונצמד לגדיל ההומולוגי של ה mRNA. זיהוי הרצף ההומולוגי ע"ג ה mRNA מאפשר את מיקומו והכוונתו הספציפית של קומפלקס ה RISC. השלב הבא הוא חיתוך ה-mRNA  באזור ההומולוגיה, ובהתאם נמנעת פעולת תרגום ה- mRNA לחלבון ובכך מושתק גן המטרה. במקרים רבים תביא ההשתקה לידי שינוי בפנוטייפ של התא או האורגניזם כתוצאה מאבדן מלא או חלקי של פעילות הגן.

מגוון הדרכים להפקת RNAi

בטבע מופעל מנגנון ה- RNAi בתא כתגובה להימצאותם של תעתיקים ארוכים של מולקולות dsRNA. אלו נוצרים כתוצאה מחדירת גורם ויראלי או כתוצר שעתוק פגום. רצפים אלו נקראים microRNAs (miRNAs). רצפי ה-miRNA  מסונתזים בגרעין ולאחר מכן עוברים לציטופלזמה. שם נכנס לפעולה אנזים ה Dicer האחראי לחיתוך    ה- dsRNA לרצפים בעלי 19-25 בסיסים ( (siRNA, וכך ניתן למנוע ביטוי לא רצוי של הגן. מכאן קצרה הייתה הדרך לחיקוי התופעה על ידי הפקה מלאכותית של siRNA והחדרת הרצף לתאים.

היתרונות העיקריים בשימוש ב-  siRNA שהוכן על ידי סינתזה כימית הם במהירות ההפקה, נוחות השימוש ובספציפיות לגן המבוקש. קיימים היום רצפי מדף מוכנים לשימוש עבור מרבית הגנום של מספר גדול של אורגניזמים. בשימוש ברצפים אלה החברות המסחריות מבטיחות יכולת השתקה אפקטיבית במרבית מערכות התאים. תוך זמן קצר ניתן לתכנן ולסנתז את הרצפים האופטימליים בהתאם לקריטריונים ידועים, על ידי שימוש במנועי תכנון שהחברות מציעות באמצעות האינטרנט, בדרך כלל ללא תשלום.

יתרון נוסף לשימוש ב- siRNA סינתטי הוא היכולת לעבוד במערכות תאים הקשות בדרך כלל לטרנספקציה. רצפי ה- siRNA הסינתטיים מוחדרים לציטופלסמה ללא צורך בהחדרה לגרעין התא, כפי שמצריך השימוש בתהליך המבוסס על וקטורים פלסמידיים.

דרך מקובלת נוספת היא שימוש ב-(shRNA)short hairpin RNA באמצעות וקטורים פלסמידיים. אפשרות זו, המערבת תהליכים אנזימטים לשיבוט וחיתוך ה RNA, נשענת על המנגנון התוך תאי של התא המארח, שבעזרתו נוצרים בתא רצפי dsRNA קצרים. וקטורים פלסמידיים שונים המותאמים לביטוי siRNA קיימים באופן מסחרי. שימוש בןוקטורים פלסמידיים מאפשר בדרך כלל השתקה לזמן ממושך יותר לעומת שימוש ב siRNAסינתטי. תכנוןshRNA  כולל את מבנה "ראש הסיכה" ולא רק את תכנון הרצף, שכן גודל הלולאה וארגונה משמעותיים ליכולת התפקוד של ה- shRNA. נושאים נוספים שיש להביא בחשבון בשימוש בווקטורים הם בקרת ריכוזי ה- siRNA המתבטאים בפועל בתא ומניעתם של        effects off-target, היכולים להיווצר כתוצאה מאחד או יותר מהשלבים המעורבים בתהליך.

השלבים העיקריים בתכנון מחקר ויישום טכנולוגית ה RNAi

* בחירת סוג התאים ואופן הטרנספקציה - בהתאם לבחירת סוג התאים יש לבחור את דרך החדרת רצפי ה-dsRNAs לתא (lipid-mediated, electroporation, etc.) ואת התנאים האופטימליים.  יכולת הטרנספקציה היא עלת חשיבות מהותית בהצלחת המערכת. בשוק קיים היום מבחר רב של ראגנטים וטכנולוגיות החדרה לשימוש במערכות RNAi, ועל החוקר לבצע בדיקה לגבי הדרך האופטימלית למערכת שבה הוא עובד.

* תכנון ה- siRNA המתאים - שלב זה מחייב התייחסות למספר גורמי מפתח:

- בחירת רצף ה mRNA שמקורו בגן המטרה. בהתאם למין האורגניזם (species) חשוב לוודא את מהימנות רצף ה- mRNA המופיע במאגר המידע הגנומי ומידת אמינותו. בנוסף, יש להביא בחשבון את האפשרות להיווצרות Splice variants ומצבים טבעיים בגנום כדוגמת Nested genes (גנים היושבים בתוך גנים) או SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), היכולים ליצור בעייתיות בבחירת רצף ה- mRNA שיביא להשתקת ביטוי הגן.

- התאמת הרצף למנגנון הפעולה. יכולת פעולה ספציפית של ה- siRNA תלויה בראש ובראשונה בתכנון נכון של הרצף. רצף זה קובע בין השאר את המבנה המרחבי של המולקולה ומשפיע השפעה      ישירה על יכולת האינטרקציה עם קומפלקס ה-RISC. רק אותן מולקולות בעלות מבנה מרחבי מתאים יוכלו ליצור קומפלקס RISC פעיל, שיגרום לעיכוב ביטוי ה mRNAההומולוגי. תכנון זה,       הנקרא תכנון מושכל (Rational Design), מבוסס על מספר פרמטרים תרמודינמיים ושיקולים נוספים כגון: אחוז צמדי הבסיסים (guanosine) G ו(cytosine) C שיוצרים קישור חזק יותר מאשר צמדי הבסיסים adenosine) )A ו-(thymidine) T, הימנעות מחזרות פנימיות של רצף הנוקלאוטידים, יציבות נמוכה בקצה 3' של גדיל ה-sense, מתן משקל יתר לבסיסים במיקומים מסוימים ברצף לדוג' U במקום 9 של גדיל ה-sense ועוד. פרמטרים אלו נאספים על סמך ניסיון מחקרי ומתעדכנים עם הזמן. פירוט ניתן למצוא במאמרים רבים וכן במנועי התכנון שמציעות מספר חברות מובילות בתחום.

- שימוש במספר siRNA כנגד אותו גן - לאחרונה מודגשת החשיבות לבחירת יותר מרצף אחד להשתקת אותו גן מטרה. שימוש במקבץ    (pool) המכיל כ- 4 siRNA שונים (לדוג'  SMARTpool®  של חברת Dharmacon ) מגביר את יכולת ההשתקה באופן ניכר ומצמצם את השפעות הלוואי.

* השפעות לוואי (Off-Target Effects)  

  - ספציפיות רצף ה-siRNA  לגן המטרה בלבד. לאחר בחירת הרצפים האופטימליים יש לערוך סריקה (blast) מול יתר רצפי mRNA המאומתים במאגר הנתונים של הגנום, לשם בדיקת ספציפיות הרצפים כנגד גן המטרה בלבד ושלילת השפעה אפשרית על גנים אחרים בגנום של האורגניזם הנבדק.

- תגובת IFN - בתאי יונקים קיים מנגנון חיסוני טבעי המופעל גם הוא באמצעות רצפים של dsRNA. רצפים ארוכים (30 זוגות בסיסים ומעלה) של dsRNA גורמים ליצירת תגובה דלקתית על ידי יצירת חלבוני אינטרפרון (IFN), אשר מובילה לעיכוב בביטוי גנים. מנגנון עיכוב זה הוט ברמת התרגום ומושג על ידי הפעלת מסלול ה- Protein Kinase Receptor (PKR). אף על פי שרצפי   ה-siRNA קצרים יותר, מחקרים הראו כי במערכות מסוימות רצפים אלו יכולים לעורר תגובת IFN. עבודה עם siRNA שתוכנן אופטימלית מאפשר עבודה בריכוזי  siRNA נמוכים ומפחית מאוד את הסיכוי להשפעות לוואי. בדרך כלל מומלץ לעבוד בריכוזי  siRNA של עד 100 nM, אך בכל מקרה יש צורך בכיול כל מערכת באופן ספציפי לבחינת ריכוזי העבודה האופטימליים של כלל רכיבי המערכת. 

* בחירת הביקורות למערכת ה RNAi – כמו בכל כלי מחקר, האפקטיביות המְרבית בשימוש ב-RNAi תושג על ידי שימוש בביקורות מתאימות. עובדה זו היא קריטית במיוחד במערכות אלו. מחקרים מראים בבירור, שהפעלה של גן אכן מושפעת מגורמים שונים בתא, המופעלים במגוון מסלולים כתגובה להתרחשויות שונות. דאגת החוקרים בתחום ה-RNAi היא במיוחד מהטיפולים הכימיים והפיזיקליים הנעשים לשם החדרת ה-siRNA לתא. גם טיפולים אלו יכולים להשפיע על ביטוי הגן הנבדק ולגרום למיסוך השפעות מערכת ה- RNAi הנבדקת.  מטעמים אלו הקמת מערכת ביקורות קריטית לבחינת התוצאות ומשמעותן. לכל שלב בתהליך יש לקבוע את הביקורת המתאימה. החל ב-                          MOCK transfection (no siRNA), ביקורת ברמת הטרנספקציה כגון Cytotoxic RNA-based reagent , שתגרום למוות של התאים כאשר מתבצעת טרנספקציה, וכלה בביקורות חיוביות, כגון רצף siRNA בעל פעילות ידועה נגד גן הקיים במערכת וכדומה.

* השגת מידע אודות נוכחות וזמן מחצית החיים של mRNA לגן המטרה או החלבון שאותו מעונינים להשתיק.

* בחינת אפשרויות המדידה של רמות ה mRNA , החלבון או הביטוי הפנוטיפי של גן המטרה.

יישומים עכשוויים ועתידיים לטכנולוגית ה- RNAi

תופעה זו של השתקת גנים באמצעות RNAi נשמרה מבחינה אבולוציונית  ונצפתה כמעט בכל היצורים האאוקריוטים, מצמחים עד לנמטודות, מזבוב הפירות ועד לאדם. אך בכל המקרים התצפיות נערכו בתרביות תאים. רק בשנת 2002 הצליח לראשונה החוקר ד"ר מקאפריי (McCaaffrey) למנוע ייצור חלבון על ידי שימוש בטכנולוגיית ה-RNAi בעכברים חיים, ולהדגים על ידי כך אפשרות לריפוי צהבת מסוג C  (Hepatitis C). מאז התפשט השימוש בטכנולוגיה זו גם למחקרים למטרות רפואיות נוספות ודווח על מחקרים במחלות מח, מחלות עור וכן מחלות קרדיו-ואסקולריות. טכנולוגיה זו מושכת תשומת לב רבה בתחומי מחקר ביוטכנולוגיים ובתעשיית הפרמצבטיקה (pharmaceutical industry), כבעלת ערך בחקר תפקודי הגנים וגילוי תרופות חדישות.

הסיבה שהיא מעוררת עניין בקרב החוקרים וכן בקרב בעלי הון היא יכולתה הסלקטיבית לגרום לעיכוב. כך ניתן לבודד את תרומתו של גן ספציפי לתא, או על ידי שימוש בטכניקת  High- Throughput ((HTS ללמוד על תרומתם של מספר גנים בו זמנית. יכולת זו מאפשרת ניצול המידע הגנטי הנצבר בפרויקט הגנום ללימוד תפקידיו של כל אחד מהגנים, באופן החוסך בזמן ובעלויות.

המכשולים העיקריים שעימם יש להתמודד על מנת לקדם פיתוח תרופות המבוססות על טכנולוגיית ה- RNAi הם  אופן העברת רצפים אלו לתאי היעד וכן מידת יציבותם בגוף החי. בהנחה שמהלך ההתפתחות הקלינית של תרופה יהיה סטנדרטי, ההערכה היא שניתן לצפות לתרופה ראשונה בעוד כ- 6 שנים. המועמדות הראשונות לתכשיר רפואי מסחרי הן תרופות המטפלות במחלות עיניים. חב' Sirna Therapeutics, Boulder, Colo.,, לדוגמה, מילאה לאחרונה בקשה לחקר תרופה חדשה (IND) על המרכיב המוביל שלהם Sirna-027, אשר לו פוטנציאל כתכשיר טיפולי במחלת ה- AMD, שבה נוצר ניוון כתמי בחלק המרכזי של הרשתית הגורם לאיבוד חלקי של הראייה. שכיחות המחלה עולה עם הגיל. הבקשה אושרה על ידי ה- FDA והתכשיר נכנס בימים אלו לניסויים קליניים

ב- Phase I. חברות נוספות יצטרפו בעתיד עם תכשירים פוטנציאלים לטיפול בתסמונת הכשל החיסוני הנרכש (HIV), דלקות כבד, סוגי סרטן שונים ועוד.

מחקרי שוק משקפים את האמונה בטכנולוגיה זו בתחזיותיהם, שלפיהן ככל שהבנת התהליך ומרכיביו השונים תגבר כך יתרחבו מספר היישומים ושוק המשתמשים. מחקר שנערך לאחרונה מעריך, כי השימוש בראגנטים בתחום ה RNAi יצמח מ- 400 מיליון דולר ב-2005 לכ-850 מיליון דולר ב-2010. בשלב זה אין עדיין הערכה מלאה, שכן אנו נמצאים בשלב מוקדם מאוד של ניסויים קליניים מבוססי טכנולוגיית ה- RNAi.

נכון להיום ברור, כי ה- RNAi היא טכנולוגיה ייחודית, שבמהרה התפשטה ככלי מחקרי חשוב ואפשר לומר אף מהפכני. שימוש בטכנולוגיה זו מהווה בסיס לפיתוח תכשירים רפואיים, אך רק אחרי שהמחקרים הרפואיים על תכשירים מבוססי RNAi יעברו לשלב קליני מתקדם, ותוכח יעילותם ניתן יהיה לדעת האם נוצרה כאן פריצת דרך רפואית של ממש.

* מנהלת שירות לקוחות ותמיכה טכנית בחברת אורנת ביוכימיקלים וציוד מעבדתי בע"מ, נציגת חברת Dharmacon בישראל.